PUREfrex®について

  • Q1:ヒト由来のタンパク質など、大腸菌以外のタンパク質も合成できますか?

    PUREfrex®は、大腸菌由来の翻訳系を再構成したタンパク質合成系ですが、哺乳類、植物などの高等真核生物由来のタンパク質も合成できます。様々なタンパク質を合成した例もありますので、こちらも参照ください

    ただし、GC含量、マイナーコドンの出現頻度などの核酸の配列により、タンパク質合成効率が低くなる傾向があります。
    タンパク質の由来よりも、鋳型DNAの塩基配列やアミノ酸配列が、合成されるタンパク質の量に影響を与えることがあり、原因となる配列を最適化することで、タンパク質の合成量が改善されることがあります。
    詳しくは、鋳型DNAに関する質問1をご覧ください。

  • Q2:PUREfrex®のタンパク質合成量はどれくらいですか?

    合成するタンパク質に依存しますが、例えば、キットに付属のコントロール鋳型DNAであるジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)は、PUREfrex® 1.0の場合、反応液1 mLあたり約150 µg、PUREfrex® 2.0の場合、反応液1 mLあたり約 600 µg、合成できます。

  • Q3:タグを付加したタンパク質は合成・精製が可能ですか?

    PUREfrex® に含まれる全てのタンパク質には、精製・検出用のタグは付加されていません。そのため、ヒスチジンタグ(His tag)を含む全てのタグ配列が使用可能です。His tag付きタンパク質の精製方法はこちらをご覧ください

  • Q4:複数のタンパク質を同時に合成することはできますか?

    異なるタンパク質をコードする複数の鋳型DNAを用いて、ひとつのチューブ内で複数のタンパク質を同時に合成することが可能です。
    鋳型DNAにより合成されるタンパク質の量が異なる場合には、添加する鋳型DNAの量比を調整することで、タンパク質の合成量も調整可能であるという実験結果が得られています。
    IgGの軽鎖 (LC) と重鎖 (HC)を同時に合成した結果をご覧ください

  • Q5:PUREfrex®で合成できるタンパク質の分子量は?

    数残基のペプチドから、約100 kDaの分子量のタンパク質も合成できます。β-Galactosidaseを合成した例もございますので、こちらもご覧ください

  • Q6:分子シャペロンは含んでいますか?

    PUREfrex®は転写・翻訳に必要な因子のみを再構成したタンパク質合成系のため、分子シャペロンは含みません。ジーンフロンティアでは、PUREfrex®に添加してお使い頂ける、Hsp70 (DnaK Mix: #PF003-0.5)やHsp60 (GroE Mix: #PF004-0.5)などの分子シャペロンをご用意しております。

  • Q7:ジスルフィド結合を有するタンパク質(抗体など)を合成できますか?

    合成可能です。タンパク質の活性にジスルフィド結合が必要な場合には、PUREfrex®に添加剤のDsbC Set (#PF005-0.5)やPDI Set (#PF006-0.5)を添加してお使いください。合成条件の最適化にはPUREfrex® 2.1 (#PF213-0.25)をお勧めいたします。
    抗体 (IgG, Fab, scFv)の合成例はこちらをご覧ください

  • Q8:膜タンパク質は合成できますか?

    膜タンパク質も合成できます。しかし、ほとんどの場合、合成された膜タンパク質は凝集します。PUREfrex®反応液に、リポソームやナノディスクなどの脂質成分を添加して膜タンパク質を合成することにより、脂質成分に組み込まれた膜タンパク質を合成できる場合があります。
    ナノディスクを用いた合成例はこちらをご覧ください

  • Q9:糖鎖修飾やN末端修飾などの翻訳後修飾は可能ですか?

    PUREfrex®は転写・翻訳に必要な因子のみを再構成したタンパク質合成系のため、単独では糖鎖修飾やN末端修飾などの翻訳後修飾はされません。しかし、翻訳後修飾酵素やその基質を反応液に添加することで、翻訳後修飾反応を行うことができます。
    糖鎖修飾につきましてはこちらをご覧ください
    N末端アセチル化やミリストイル化につきましてはこちらをご覧ください

  • Q10:[35S]メチオニンや[3H]ロイシンなど放射性同位体で標識されたタンパク質を合成出来ますか?

    [35S]メチオニンや[3H]ロイシンなどの放射性同位体を含むアミノ酸を合成反応液に添加して合成することにより、放射性同位体で標識されたタンパク質を合成できます。なお、PUREfrex® 1.0には、20種類の天然アミノ酸が、それぞれ終濃度で0.5 mMとなるように含まれています。

  • Q11:分泌タンパク質の合成をする場合、シグナル配列は必要ですか?

    PUREfrex®で合成する場合には、シグナルペプチドは不要ですが、生体内でN末端とならない配列から翻訳が開始されることになり、合成量が低くなることがあります。そのため、シグナル配列を除いた配列(特にN末端側)を最適化することをおすすめします。詳しくは、鋳型DNAをの質問1をご覧ください。

  • Q12:PUREfrex®のコドン出現頻度は大腸菌のコドン出現頻度と同じですか?

    PUREfrex®は、大腸菌から調製したtRNA混合物を使用しているため、各tRNA濃度は、大腸菌内のtRNA濃度を反映しています。そのため、大腸菌内で少ないtRNAは、PUREfrex®反応液の中でも少なくなっています。
    上記の理由から、PUREfrex®で合成するタンパク質の鋳型DNAは、大腸菌の使用頻度に合わせたコドンをご使用頂くよう推奨しています。その他、鋳型DNAを設計する際の注意点について、こちらもご覧ください

  • Q13:PUREfrex®で発現したタンパク質/ペプチドのN末端メチオニンはホルミル化されていますか? ホルミル化される場合、翻訳中/翻訳後に脱ホルミル化されることはありますか?

    PUREfrex®で合成されたタンパク質のN末端メチオニンはホルミル化されています。また、これらは翻訳中/後も脱ホルミル化されません。
    ただし、合成されるタンパク質量によっては、ホルミルドナーが枯渇し、一部ホルミル化されていないタンパク質が混在することもあります。PUREfrex®は、N末端メチオニンがホルミル化されていなくても翻訳反応が進みますが、合成するタンパク質によっては合成効率に影響があります。