3．セレクションの方法

まず、450億パターンの抗体配列を含むライブラリから、ファージを介して1つずつ提示された抗体と、固定化した抗原を結合させるセレクション（パニング）を行います。つぎに、パニングで抗原と結合したファージのプールから、抗体配列を含む部分を、大腸菌の発現ベクターに組換え形質転換を行います。このようにして得られた形質転換体から、抗体を組換えタンパク質として発現させ、得られた抗体と抗原の反応性をELISAで確認しながらセレクションを行っていきます。

3-1．パニング

抗原を固定し、抗原への反応 → 反応しないファージの洗浄 → 反応したファージの回収と増殖（1ラウンド）を3ラウンド繰り返します。 3ラウンドの中で、抗原１と抗原２を交互に用いてパニングを行います。

1. ラウンド：抗原1（biotin-BSA-MBS-Ag1）
2. ラウンド：抗原2（biotin-Trf-SMCC-Ag2）
3. ラウンド：抗原1（biotin-BSA-MBS-Ag1）

3-2．スクリーニングELISA

抗原1と抗原2をそれぞれ固定したプレートを用いてELISAを行い、プレート1とプレート2の両方で陽性となるクローンを選定します。

• プレート1：抗原1を固定（biotin-BSA-MBS-Ag1）
• プレート2：抗原2を固定（biotin-Trf-SMCC-Ag2）

4．セレクションのポイント

4-1．抗原の設計

今回は、抗原の配列が重要になってくるため、ペプチドを抗原として使用しました。認識してほしくないタンパク質が特定できていれば、そのタンパク質とホモロジーのある配列を除いて抗原を設計できるため、より目的の特異性をもった抗体のセレクションが可能になります。

設計するペプチド抗原の長さは、15～20アミノ酸の長さが目安になります。また、キャリアタンパク質とのコンジュゲートを作製する場合、ペプチドの末端にCysを付加するため、抗原の配列中にCysが含まれなことも大事なポイントになります。

どうしても、配列中にCysが含まれる場合は、ペプチドにPEGとビオチンを付けて合成を行い、抗原として用います。PEG-ビオチン化したペプチドを抗原として用いる場合、キャリアタンパク質とのコンジュゲートを抗原として用いる場合と比較して、単位面積あたりの抗原提示量が少なくなるため、抗原配列中にホモロジーが低い配列の領域が少ない場合には、目的の抗体が得られる確率が低くなる傾向があります。

4-2．抗体の特異性を上げる

下記の部分を認識する抗体を排除するために、抗体職人では次のような施策を行っています。

• ペプチド抗原の末端
• キャリアタンパク
• 架橋剤

ペプチド抗原のN末とC末に、それぞれ異なる架橋剤とキャリアタンパク質の組み合わせで、コンジュゲートを作製します。これらのコンジュゲートを、交互に抗原として固定してパニングを行うことにより、各パニングで共通していた部分、つまり、末端以外の部分に結合してくる抗体をセレクションすることができます。ELISAスクリーニングでも、両コンジュゲートに陽性のクローンを選択していくことで、セレクションされる抗体の特異性を高めています。

5．まとめ

高いホモロジーをもつタンパク質の違いを見分ける抗体を作製する場合、次のポイントに注目し、抗原の設定とセレクションの方法を決めていきます。

1. 認識してほしくないタンパク質の配列はわかっているか
2. 相同性の低い配列の長さはどの程度か
3. 配列中にCysは含まれていないか

ご希望の抗体が作製可能かどうか、まずは、お気軽にご相談ください。