PUREfrex^®は、大腸菌由来の翻訳系を再構成したタンパク質合成系ですが、哺乳類、植物などの高等真核生物由来のタンパク質も合成できます。様々なタンパク質を合成した例もありますので、こちらも参照ください。

ただし、GC含量、マイナーコドンの出現頻度などの核酸の配列により、タンパク質合成効率が低くなる傾向があります。
タンパク質の由来よりも、鋳型DNAの塩基配列やアミノ酸配列が、合成されるタンパク質の量に影響を与えることがあり、原因となる配列を最適化することで、タンパク質の合成量が改善されることがあります。
詳しくは、鋳型DNAに関する質問１をご覧ください。

合成するタンパク質に依存しますが、例えば、キットに付属のコントロール鋳型DNAであるジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）は、PUREfrex^® 1.0の場合、反応液1 mLあたり約150 µg、PUREfrex^® 2.0の場合、反応液1 mLあたり約 600 µg、合成できます。

PUREfrex^® に含まれる全てのタンパク質には、精製・検出用のタグは付加されていません。そのため、ヒスチジンタグ（His tag）を含む全てのタグ配列が使用可能です。His tag付きタンパク質の精製方法はこちらをご覧ください。

異なるタンパク質をコードする複数の鋳型DNAを用いて、ひとつのチューブ内で複数のタンパク質を同時に合成することが可能です。
鋳型DNAにより合成されるタンパク質の量が異なる場合には、添加する鋳型DNAの量比を調整することで、タンパク質の合成量も調整可能であるという実験結果が得られています。
IgGの軽鎖 (LC) と重鎖 (HC)を同時に合成した結果をご覧ください。

数残基のペプチドから、約100 kDaの分子量のタンパク質も合成できます。β-Galactosidaseを合成した例もございますので、こちらもご覧ください。

PUREfrex^®は転写・翻訳に必要な因子のみを再構成したタンパク質合成系のため、分子シャペロンは含みません。ジーンフロンティアでは、PUREfrex^®に添加してお使い頂ける、Hsp70 (DnaK Mix: #PF003-0.5)やHsp60 (GroE Mix: #PF004-0.5)などの分子シャペロンをご用意しております。

合成可能です。タンパク質の活性にジスルフィド結合が必要な場合には、PUREfrex^®に添加剤のDsbC Set (#PF005-0.5）やPDI Set (#PF006-0.5)を添加してお使いください。合成条件の最適化にはPUREfrex^® 2.1 (#PF213-0.25)をお勧めいたします。
抗体 (IgG, Fab, scFv)の合成例はこちらをご覧ください。

膜タンパク質も合成できます。しかし、ほとんどの場合、合成された膜タンパク質は凝集します。PUREfrex^®反応液に、リポソームやナノディスクなどの脂質成分を添加して膜タンパク質を合成することにより、脂質成分に組み込まれた膜タンパク質を合成できる場合があります。
ナノディスクを用いた合成例はこちらをご覧ください。

PUREfrex^®は転写・翻訳に必要な因子のみを再構成したタンパク質合成系のため、単独では糖鎖修飾やN末端修飾などの翻訳後修飾はされません。しかし、翻訳後修飾酵素やその基質を反応液に添加することで、翻訳後修飾反応を行うことができます。
糖鎖修飾につきましてはこちらをご覧ください。
N末端アセチル化やミリストイル化につきましてはこちらをご覧ください。

[35S]メチオニンや[3H]ロイシンなどの放射性同位体を含むアミノ酸を合成反応液に添加して合成することにより、放射性同位体で標識されたタンパク質を合成できます。なお、PUREfrex^® 1.0には、20種類の天然アミノ酸が、それぞれ終濃度で0.5 mMとなるように含まれています。

PUREfrex^®で合成する場合には、シグナルペプチドは不要ですが、生体内でN末端とならない配列から翻訳が開始されることになり、合成量が低くなることがあります。そのため、シグナル配列を除いた配列（特にN末端側）を最適化することをおすすめします。詳しくは、鋳型DNAをの質問１をご覧ください。

PUREfrex^®は、大腸菌から調製したtRNA混合物を使用しているため、各tRNA濃度は、大腸菌内のtRNA濃度を反映しています。そのため、大腸菌内で少ないtRNAは、PUREfrex^®反応液の中でも少なくなっています。
上記の理由から、PUREfrex^®で合成するタンパク質の鋳型DNAは、大腸菌の使用頻度に合わせたコドンをご使用頂くよう推奨しています。その他、鋳型DNAを設計する際の注意点について、こちらもご覧ください。

PUREfrex^®で合成されたタンパク質のN末端メチオニンはホルミル化されています。また、これらは翻訳中/後も脱ホルミル化されません。
ただし、合成されるタンパク質量によっては、ホルミルドナーが枯渇し、一部ホルミル化されていないタンパク質が混在することもあります。PUREfrex^®は、N末端メチオニンがホルミル化されていなくても翻訳反応が進みますが、合成するタンパク質によっては合成効率に影響があります。

鋳型DNAの作製と最適化のポイントにつきましては、以下のページにまとめてありますので、ご覧ください。
鋳型DNAについて
鋳型DNAの配列に関する６つの注意点

鋳型DNAには、目的タンパク質をコードする遺伝子の上流に、T7プロモーター配列とリボソーム結合部位（SD配列）が最低限必要です。

PUREfrex^®の反応液には、転写酵素としてT7 RNAポリメラーゼが含まれていますので、T7プロモーターを付加した鋳型DNAの使用を推奨しています。他のプロモーターを使用する場合は、そのプロモーターに対応したRNAポリメラーゼを添加して反応してください。

はい。
ただし、5’UTR配列がタンパク質合成量に影響することがわかっています。5’UTR配列が合成収量に与える影響を調べたポスターを参照ください。今のところ、弊社が設計した５’UTR配列が最も高いタンパク質の合成量を示しています。配列中の各領域によって、合成量に及ぼす影響が異なりますので、実験に目的に応じて調整してください。

PUREfrex^®に含まれる2種類の翻訳終結因子（解離因子）は、3種類存在する終止コドン（UAA（オーカー）、UAG（アンバー）、UGA（オパール)）の全てに対応しているため、いずれの終止コドンも使用できます。

環状DNAを使用する場合は、目的タンパク質をコードする遺伝子の下流に、転写を終結させるT7ターミネーター配列が必要です。直鎖DNAを使用する場合、終止コドンの下流に10塩基以上の塩基を付加してください。直鎖DNAの場合は、終止コドンの下流にT7ターミネーター配列は必ずしも必要ではありません。

“REV primer”について、基本的には任意ですが、いくつかポイントがあります。
・ORF部分のC末端以降の”taatga”となる部分は終止コドンを２つ並べた配列になっています。
・配列よりも、長さの方が重要で、10塩基より短いと合成効率に影響が出てきますが、10塩基よりも長い分には、20塩基等でも大丈夫です。
・できるだけ、終止コドン直後に固い二次構造を形成するような配列（GC含量が高いなど）は避けてください。
・例えば、この部分に制限酵素サイトを入れることができます。

プラスミドやPCR産物に関わらず、DNAは、1kbpあたり0.5-3 ng/µLになるように添加してください。
PUREfrex反応液に添加するDNAは、分子数（モル濃度）が基準となっており、最終濃度が 2nM 前後となるように添加してください。例えば、反応液に添加するDNAがプラスミド（環状DNA）で、その長さが6kbpの場合、実際のORFの長さに関係なく、(0.5～3)x6=3～18ng/μLとなります。

TEバッファーに含まれるEDTAは、転写・翻訳反応を阻害してタンパク質合成量を下げることがあります。DNAを溶解する際には、EDTAを含まないバッファーやミリQ水などを使用することをおすすめします。

PCR反応液からの塩などの持ち込みを抑えるため、添加量はPUREfrex^®の反応液量の1/10 以下にしてください。転写・翻訳反応とも、PCR反応液からの持ち込みによる塩濃度の変化などによって活性が低下します。
PCR産物量が不足している場合は、未精製のPCR反応液の添加量を増やすことは避け、DNA精製キットなどを用いて十分な濃度になるようにDNA溶液を調製してください。
【参考】PCR産物を鋳型DNAとして使用する場合

PCR後の電気泳動で目的産物以外にバンドが見られる場合は、PCR条件を検討して副産物の生成を抑えてください。副産物からもタンパク質が合成されることがあり、PCRで得られるバンドの純度がタンパク質の合成効率に影響します。PCR条件を変更しても副産物が生じる場合は、目的のバンドをゲルから切り出して精製してください。ゲルから切り出す際には、DNAの損傷（転写反応が阻害されます）を防ぐために紫外線は照射しないでください。ブルーライトは使用可能ですが、できるだけ照射時間を短くしてください。
【参考】 PCR産物を鋳型DNAとして使用する場合

プロモータ配列込みで人工合成したフラグメントを、鋳型DNAとして使用することは可能です。また、ORFのみを合成したDNAから、プロモーター配列など必要な配列を含むプライマーを使用してPCRで鋳型DNAを作成して使用することもできます。しかし、遺伝子合成のメーカーによっては、納品物にタンパク質の合成反応を阻害するRNaseが含まれていることがあります。目的タンパク質が合成できない場合は、RNaseインヒビターの添加やRNaseの不活化をお試しください。
また、プラスミドの形態で納品されるのものについては、プラスミドを鋳型DNAとして用いる場合の注意点もご確認ください。

T7 promoter、SD配列、T7 terminatorを含むベクターが使用できます。例えば、pET系（Merck社）、pQE系（Qiagen社) 等があります。但し、lac operator配列が存在すると、タンパク質合成量が減少する場合がありますので、lac operator配列を含まないベクター（pET17など）をおすすめします。

プラスミドDNAを調製する際は、精製時に使用したバッファーに添加したRNaseの活性が最終精製物に残っていないことが重要です。
例えば、Qiagen社のQIAprep Spin Miniprep Kitや、Promega社のWizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systemのようなメンブレンタイプの精製キットを使用した場合、Lysis bufferに含まれるRNase Aが最終精製DNA溶液にも混入しています。このまま鋳型DNAとしてPUREfrex^®の反応液に添加すると、転写産物などのRNAが分解されタンパク質の合成が阻害されます。
このタイプの精製キットで精製したDNA溶液の場合、Phenol/Chloroform処理によりRNaseを失活させた後、エタノール沈殿などにより再度精製することで、RNase活性を含まないDNA溶液を調製できます。あるいは、RNase inhibitorをPUREfrex^®の反応液に添加することで、タンパク質を合成できるようになります。一方、Qiagen社のPlasmid Mini Kitでは、樹脂に結合したDNAを溶出後、溶出液にisopropanolを加えてDNAを沈殿させるため、RNase活性の混入が抑制されます。このキットで精製したプラスミドを、そのまま使用できることを確認しています。
【参考】プラスミドを鋳型DNAとして用いる場合の注意点

mRNAからタンパク質を合成する場合、開始コドンの上流にSD配列を含むmRNAを使用してください。また、mRNAの添加濃度の目安は0.1～1 µMです。ご使用のmRNAの配列や純度等により最適濃度は異なりますので、はじめに、上記の濃度を参考に最適な添加濃度を決める条件検討をおすすめします。

はじめてお試しいただく合成温度は、37℃で2～4時間の反応を推奨しています。しかし、最適な合成温度はタンパク質によって異なるため、37℃で合成すると、不溶化がみられたり、活性が低い場合には、他の温度での合成をお試しいただくことをおすすめします。詳しくは、こちらもご覧ください。

合成温度を37℃から30℃や25℃に下げると、翻訳速度が遅くなり、一般に目的タンパク質の合成量は少なくなります。一方、翻訳速度に比べてフォールディング速度は遅い場合が多いため、翻訳速度を遅くすると、目的タンパク質の可溶性が改善する場合があります。
詳しくは、こちらもご覧ください。

PUREfrex^®の反応液は、pHが7.5付近になるようにバッファーが添加されています。そのため、酸やアルカリを添加される場合には、反応液のpHが中性付近になるように調整してください。

PUREfrex^® 1.0の反応液中の終濃度が10-20mMの範囲であれば、タンパク質の合成量に影響はありません。

マグネシウムイオンは、PUREfrex^® 1.0 反応液中の終濃度が数mM程度であればタンパク質の合成量にあまり影響はありません。その他の2価カチオンは、PUREfrex^® 1.0 反応液中の終濃度が10 mM以上になると、タンパク質の合成量が減少する場合が多いため、できるだけご使用を避けてください。

PUREfrex^®反応液へのキレート剤の添加によるマグネシウムイオンの減少は、タンパク質の合成量に非常に影響を与えるため、できるだけご使用を避けてください。

PUREfrex^® 1.0 反応液中の終濃度が数%程度であれば、タンパク質の合成量に影響はありません。

PUREfrex^®は、終濃度1.5%のグリセロール存在下でタンパク質の合成が行われています。グリセロールを添加する場合、反応液中の終濃度が5%以下であればタンパク質の合成量にほとんど影響はありませんが、高濃度のグリセロールはタンパク質の合成を阻害します。

1) PUREfrex^®の反応液は、反応チューブを直接加温できるヒートブロック又はウォーターバスで反応させてください。気相の恒温槽（培養用恒温器など）で反応すると、反応液の温度の上昇に時間がかかり、合成量が低くなることがあります。

2) キットの構成成分が失活している可能性があります。失活を防ぐために、キットは適切な温度で保存してください。また、キットの溶液を小分けにして保存するなどして、凍結融解の繰り返しをできるだけ避けてください。

3) システインを添加していない可能性があります。PUREfrex^® 2.1では還元剤（システイン、DTT、GSHなど）の添加量を自由に調整することができますが、システインはタンパク質の材料でもあるので、必ず添加してください。

1) 鋳型DNAに最低限必要な配列が含まれていない可能性があります。PUREfrex^®で使用する鋳型DNAには、T7プロモーター、リボソーム結合部位（SD配列）、開始コドン、終止コドンが必要です。

2) 反応液へのDNA添加量が多い、あるいは少ない可能性があります。プラスミドやPCR産物に関わらず、DNAは、1 kbpあたり0.5～3 ng/µLになるように添加してください。添加量が多い場合もタンパク質の合成量が下がる場合があります。PUREfrex^®反応液に添加するDNAは、分子数(モル濃度)が基準となっているため、例えば、反応液に添加するDNAがプラスミド(環状DNA)で、その長さが6 kbpの場合、実際のORFの長さに関係なく、(0.5～3)×6=3～18 ng/µLとなります。

3) 鋳型DNAの調製方法が適切ではない可能性があります。「鋳型DNAについて」のページをご覧ください。

4) 鋳型DNAの配列に合成されにくい配列が含まれている可能性があります。
「鋳型DNAの配列に関する６つの注意点」のページに記載されているような配列が含まれていないか確認してください。

1) 分子シャペロンを添加して合成することで改善される可能性があります。PUREfrex^®には、分子シャペロンが含まれていません。そのため、分子シャペロンを添加して合成すると可溶化することがあります。また、PUREfrex^® 2.0よりも、合成量が少ないPUREfrex^® 1.0を用いて合成した方が良い結果が得られることがあります。

2) 翻訳のスピードを下げて合成する。一般に、翻訳速度に比べてフォールディングの速度は遅い場合が多いため、合成温度を37℃から30℃や25℃に下げて翻訳速度を遅くすると、目的産物の可溶性の割合が増大する場合があります。その際、合成量も少なくなりますので、可溶性タンパク質が効率よく得られる条件を検討してください。

詳しくは、こちらもご覧ください。

1) 合成したタンパク質が不溶化している可能性がありますので、可溶性を確認してください。

2) 活性を得るために必要な因子（補酵素や金属イオンなど）が足りないことがあります。PUREfrex^®は再構成系であるため、転写・翻訳反応に関係のない低分子などは含まれていません。活性に必要な因子を添加してください。

3) ジスルフィド結合が正しく形成される必要がある場合には、その形成を促進する添加剤（DsbC SetまたはPDI Set）をお試しください。

詳しくは、こちらもご覧ください。

PUREfrex^®反応液は、比較的塩濃度が高いため、反応液に直接SDSを含むサンプルバッファーを添加して加熱すると白濁する場合があります。白濁を避けるためには、合成後の反応液を等量以上の水で希釈した後に、サンプルバッファーを添加してください。白濁が解消されない場合は、低めの温度（37℃など）で長め（1時間程度）の加熱処理を行ってください。