N末端側のHisタグが原因の合成量低下を改善

α-SynucleinのN末端にHisタグを付与してタンパク質合成を行った場合、Hisタグの配列によっては、合成量が低下することがあります。この合成量の低下を、Hisタグの遺伝子配列を変えるだけで、改善できることを確認しました。

合成・SDS-PAGEのプロトコル

使用したキット:PUREfrex®2.0(#PF201-0.25)
目的のタンパク質:Hisx6-α-Synuclein(Homo sapiens)
分子量:15,427 Da
反応液量:10 µL
合成温度:37 °C
合成時間:4 時間
SDS-PAGEアプライ量:1 µL
ゲル濃度:10-20 % gradient
ゲル染色:CBB

Hisタグの遺伝子配列が異なる2種類の鋳型DNAを作成

鋳型DNAは、開始コドン直後にHisタグ、Gly、Serと続き、その下流にα-Synucleinの2Aspから140Alaで構成されています。

合成結果

鋳型DNAのN末端から9アミノ酸のGC含量が低くなる方の鋳型DNAから合成したタンパク質の方が、GC含量が高くなる鋳型DNAよりも多く合成される結果が得られました。この結果から、Hisタグの配列をcatにすることで、Hisタグを付けたことによる合成の低下を改善することができます。

N末端の配列をATリッチにすることで、タンパク質の合成量が改善されます。他のタンパク質について調べた結果をポスター発表しておりますので、こちらもご覧ください。

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