試験管内で合成したタンパク質が凝集し不溶化してしまうことは、しばしばみられる現象です。このような場合、細胞内と同様に、シャペロンが介在することで、可溶化できることがあります。

ここでは、PUREfrex^® にシャペロンを添加した効果についてまとめています。合成したタンパク質に凝集がみられる場合、参考にしてみてください。

１．DnaK Mix（Hsp70）の効果

DnaK は大腸菌の Hsp70 で、新生タンパク質の構造形成や、タンパク質の品質管理に関与していることが知られています。DnaK は ATPase であり、DnaJ、GrpE と協調して働きます。DnaJ は、DnaK の ATP 加水分解反応を促進し、タンパク質の疎水領域への結合活性も有しています。GrpE は、DnaK 上の ADP/ATP 交換反応を促進します。DnaK Mix（#PF003）は、高度に精製した大腸菌由来の DnaK、DnaJ、GrpE を適切な濃度比であらかじめ混合した溶液です。

１-１．タンパク質合成時に添加

ヒト癌遺伝子 HER2/neu（c-erbB-2）の遺伝子産物である HER2 蛋白に特異的に結合するモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（Trastuzumab；商標名 Herceptin ）の H 鎖と L 鎖をそれぞれ鋳型 DNA として、最適な濃度比で反応液に添加して合成しました。その結果、シャペロンを添加した方が、IgG の Y 字構造を形成する効率が高く、特に DnaK Mix が最も高い効果を示していました。詳細は、こちらのポスターをご覧ください。
”再構成型無細胞タンパク質合成システムPUREfrexを用いた全長IgG抗体の合成法開発”

• DnaK mix: Mixture of cytoplasmic molecular chaperones from E. coli, which contains 5 µM DnaK, 1 µM DnaJ, 1 µM GrpE.
• FkpA: Periplasmic peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) from E. coli, which has a chaperone-like function independent of PPIase activity.
• Skp: Periplasmic protein from E. coli, which shows chaperone-like activity to β-barrel protein.

１-２．添加量を最適化

バクテリアの一種 Cytophaga hutchinsonii 由来II型ポリリン酸キナーゼ（PPK2）の C 末端に His タグを付けた鋳型 DNA を用いて、シャペロンが共存する状態でタンパク質の合成を行いました。その結果、DnaK Mix がない状態で合成すると、合成されたタンパク質のほとんどが不溶化してしまいましたが、DnaK Mix と共存させて合成すると可溶化率が高くなり、DnaK Mix の添加量を上げるとさらにその効果が高くなりました。反応条件などの詳細は、こちらのポスターをご覧ください。
”活性型タンパク質合成のための、再構成型無細胞タンパク質合成系(PUREfrex^®)を用いたアプローチ”

１-３．タンパク質合成後に添加

ルシフェラーゼ（Photinus pyralis 由来）の鋳型 DNA を用いてタンパク質合成を行ったあとの反応液に、直接 DnaK Mix や ClpB を添加しました。シャペロンを添加しない場合と比べ、可溶化率は高くなり、DnaK Mix と ClpB の両方を混ぜると、可溶化したタンパク質量、活性ともに大幅に増加しました。反応条件などの詳細は、こちらのポスターをご覧ください。
”活性型タンパク質合成のための、再構成型無細胞タンパク質合成系(PUREfrex^®)を用いたアプローチ”

２．GroE Mix（Hsp60）の効果

GroEL は大腸菌の Hsp60 で、一部の新生タンパク質の構造形成や、品質管理に必須であることが知られています。GroEL は14量体のダブルリング構造を持つ ATPase であり、7量体の GroES と協調して働きます。GroE Mix（#PF004）は、高度に精製した大腸菌由来の GroEL、GroES を適切な濃度比であらかじめ混合した溶液です。

GroE Mix を添加した PUREfrex^®1.0 を使用して、4 種類の大腸菌タンパク質（FadA、HemB、PepQ、PyrC）^*1 を合成し、合成産物の可溶性を測定しました。その結果、GroE Mix を添加せずに合成した場合は、4 種類とも、合成産物はすべて沈殿画分に回収されました。一方、GroE Mix を添加して合成した場合、ほとんどの合成産物が上清画分に回収されました。
*1）FadA, HemB, PepQ, PyrC 大腸菌内でのGroEの基質として報告されているタンパク質
(Ref; Fujiwara et al. (2010) EMBO J, 29, 1552-1564)

合成後の反応液（T）、沈殿画分（P）、上清画分（S）

３．まとめ