DS supplement

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細胞外に分泌されるタンパク質など、タンパク質の種類によっては、正しい高次構造の形成や維持に、ジスルフィド結合 disulfide bond (SS結合 SS-bond またはジスルフィド架橋 disulfide bridge とも呼ばれる)が必要な場合があります。ジスルフィド結合は、近接する2つのシステイン側鎖のスルフヒドリル(SH-)基が酸化されて形成される結合のため、ジスルフィド結合形成には酸化剤を含む環境が必要です。また、正しいシステイン間でのジスルフィド結合形成には、ジスルフィド結合イソメラーゼ活性を有する酵素が必要な場合もあります。

DS supplement は、PUREfrex®1.0(#PF001-0.25)PUREfrex®2.0(#PF201-0.25)PUREfrex®2.1(#PF213-0.25)に添加することで、ジスルフィド結合形成に最適な環境を作り出します。DS supplement は、酸化的な環境にするための酸化剤として、酸化型グルタチオン(GSSG)、ジスルフィド結合イソメラーゼとして大腸菌の DsbC が含まれています。タンパク質の活性にジスルフィド結合が必要な場合にお使いください。

DS supplement は、DnaK Mix(#PF003-0.5)GroE Mix(#PF004-0.5)等の分子シャペロンとともに、PUREfrex®1.0(#PF001-0.25)PUREfrex®2.0(#PF201-0.25)に添加してお使い頂けます。正しい高次構造が形成できず、不溶性となるようなタンパク質合成時にお奨めいたします。

製品番号 製品名称 容量 MSDS*1 価格(税抜) 説明書
PF005-0.5 *2 DS supplement 500 µL 反応用 10,000円 PDF

*1)MSDS欄に – が表示されている場合は、MSDS制度の対象となる化学物質は含まれておりません。

利用例

製品構成

 

  容量 内容 開封後保存温度*1
GSSG 25 μL 酸化型グルタチオン (60 mM) -20℃
DsbC 25 μL 大腸菌 DsbC (7.5 mg/mL) -20℃もしくは-80℃ *2
Dilution Buffer 500 μL 30%グリセロール溶液 -20℃

*1) キット開封前は、-80℃で保存してください。
*2) 使用後の残りの反応液を-80℃で保存する場合は、液体窒素やドライアイス/エタノールなどで急速凍結してから保存してください。必要に応じて分注し、凍結融解の繰り返しをできるだけ避けてください。

使用方法

DS supplement は、PUREfrex®1.0(#PF001-0.25)PUREfrex®2.0(#PF201-0.25)PUREfrex®2.1(#PF213-0.25)を用いたタンパク質合成反応で使用できます。例えば、タンパク質合成反応を20μLで行う場合、以下のように添加して使用できます。

  1. Solution I、GSSG を37℃~質問で1分間温めて完全に融解し、氷上に置きます。
  2. Solution II、III、DsbC を氷上で融解します。
  3. 融解したSolution I、II、III、GSSG、DsbC を軽くボルテックスした後、遠心して内容物をチューブ下部に集めます。
  4. 以下のように反応液を調製します。(DNAは、1 kbpあたり0.5-3 ng/μLになるように添加してください。) PUREfrex®2.1(#PF213-0.25)は、キットの内容物が異なるPUREfrex®1.0(#PF001-0.25)PUREfrex®2.0(#PF201-0.25)と分けて記載しております。
      #PF001 #PF201
    Water 6-X μL 5-X μL
    Solution I 10 μL 10 μL
    Solution II 1 μL 1 μL
    Solution III 1 μL 2 μL
    GSSG 1 μL 1 μL
    DsbC 注1 1 μL 2 μL
    鋳型DNA 注2 X μL X μL
    Total 20 μL 20 μL
      #PF213
    Water 5-X μL
    Solution I 8 μL
    Cysteine 1 μL
    DTT 注3 or GSH 1 μL
    Solution II 1 μL
    Solution III 2 μL
    GSSG 1 μL
    DsbC 注1 1 μL
    鋳型DNA 注2 X μL
    Total 20 μL
  5. 37℃のヒートブロック又はウォーターバスで2~4時間反応させて、タンパク質を合成します。注4
  6. 合成されたタンパク質を、それぞれの目的に使用します。

注1. DsbC の必要濃度は、合成するタンパク質によって異なります。
DsbC の必要濃度が低い場合は、添付のDilution Buffer で希釈してください。
タンパク質を異なるDsbC 添加量で合成し、その酵素活性を比較したデータもありますので、こちらもご覧ください
注2. 鋳型DNAは、目的のタンパク質に合わせてお客様の方でご用意ください。
調製方法に関しましては、鋳型DNAのサイトをご覧ください。
注3. PUREfrex®2.0(#PF201-0.25)に含まれるDTTの終濃度は 2 mMです。
注4. 気相の恒温槽(培養用恒温器など)で反応すると、反応液の温度の上昇に時間がかかり、合成量が低くなります。

使用上の注意

DS supplement は研究用試薬です。ヒトを含む動物などへの投与、臨床、診断など他の用途への使用を禁じます。また、食品、家庭用には使用しないでください。
DS supplement を使用する際には、RNaseフリーの水、試薬、器具類を使用してください。また、手袋、マスクの着用をお勧めします。