DsbC Set(旧 DS supplement)

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2019年7月の出荷分より、製品名が変更になっておりますが、製品の仕様及び製品番号の変更は一切ございません。
詳しくは、こちらをご覧ください。

細胞外に分泌されるタンパク質など、タンパク質の種類によっては、正しい高次構造の形成や維持に、ジスルフィド結合 disulfide bond (SS結合 SS-bond またはジスルフィド架橋 disulfide bridge とも呼ばれる)が必要な場合があります。ジスルフィド結合は、近接する2つのシステイン側鎖のスルフヒドリル(SH-)基が酸化されて形成される結合のため、ジスルフィド結合形成にはSH基が酸化されうる環境が必要です。また、正しいシステイン間でのジスルフィド結合形成には、ジスルフィド結合異性化活性を有する酵素が必要な場合もあります。

DsbC Set(旧 DS supplement;#PF005-0.5)には、ジスルフィド結合形成が可能な環境にするための酸化剤として酸化型グルタチオン(GSSG)とジスルフィド結合イソメラーゼとして大腸菌のDsbCが含まれています。DsbC Set(旧 DS supplement;#PF005-0.5)には、タンパク質合成試薬は含まれておりませんので、PUREfrex®2.1(#PF213-0.25)に添加して使用することで、正しいジスルフィド結合を形成して活性を有したタンパク質を合成することができます。

正しい高次構造が形成できず、不溶性となってしまうタンパク質を合成する場合には、DnaK Mix(#PF003-0.5)GroE Mix(#PF004-0.5)等の分子シャペロンを反応液にさらに添加して合成することをお奨めいたします。

製品番号 製品名称 容量 国内法規制 *1 価格(税抜) 製品添付文書
PF005-0.5 DsbC Set(旧 DS supplement) 500 µL 反応用 10,000円 PDF

*1)化学物質排出把握管理促進法、労働安全衛生法、毒劇及び劇物取締法、遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律(通称「カルタヘナ法」)

製品構成

  容量 内容 開封後保存温度 *1
GSSG 25 μL 酸化型グルタチオン (60 mM) -20℃
DsbC 25 μL 大腸菌 DsbC (320 μM) *2 -20℃もしくは-80℃ *3
Dilution Buffer 500 μL 30%グリセロール溶液 -20℃

*1) キット開封前は、-80℃で保存してください。

*2) 製品名をDsbC Setに変更後は、ラベル表示がモル濃度になっています。320 μMのDsbCの濃度は、旧 DS supplementで記載の 7.5 mg/mLと同じ濃度です。

*3) 使用後の残りの反応液を-80℃で保存する場合は、液体窒素やドライアイス/エタノールなどで急速凍結してから保存してください。必要に応じて分注し、凍結融解の繰り返しをできるだけ避けてください。

使用方法

DsbC Set(旧 DS supplement)を添加したタンパク質合成は、任意の反応液量で行うことができます。例えば、PUREfrex®2.1(#PF213-0.25)を使用して、0.5 mM Cysteine、4 mM GSH、3 mM GSSG、4 μM DsbC を添加して、液量 20 μLで合成する場合は以下のように反応液を調製してください。

  1. Solution I、Cysteine、GSH、GSSG を、室温~37℃で 1 分間ほど温めて完全に融解し、氷上に置きます。
  2. Solution II、Solution III、DsbC を氷上で融解します。
  3. 融解したSolution I、II、III、Cysteine、GSH、GSSG、DsbC を軽くボルテックスした後、遠心して内容物をチューブ下部に集めます。
  4. DsbC をDilution Buffer で 4 倍に希釈します。また、GSSG を水で 3 倍に希釈します。
  5. 以下のように反応液を調製します。(DNAは、1 kbpあたり0.5-3 ng/μLになるように添加してください。)
    Water 5-X μL
    Solution I 注1 8 μL
    Cysteine 1 μL
    GSH 1 μL
    GSSG 注2 1 μL
    Solution II 1 μL
    Solution III 2 μL
    DsbC(4倍希釈) 注3 1 μL
    鋳型DNA 注4 X μL
    Total 20 μL
  6. 37℃のヒートブロック又はウォーターバスで2~6時間反応させて、タンパク質を合成します。注5
  7. 合成されたタンパク質を、それぞれの目的に使用します。

注意点

注1) PUREfrex® 1.0(#PF001)PUREfrex® 2.0(#PF201)とは使用量が異なりますので、注意してください。

注2) 使用する還元剤の種類や濃度、合成するタンパク質により、最適濃度が異なります。GSSG の添加濃度を検討する場合、1~3 mMで検討してください。

注3) DsbC の必要濃度は、合成するタンパク質によって異なります。必要濃度が不明な場合は、1~16 μMで検討してください。希釈が必要な場合は、添付のDilution Buffer を使用してください。タンパク質を異なるDsbC 添加量で合成し、その酵素活性を比較したデータもありますので、こちらもご覧ください

注4) 鋳型DNAは、目的のタンパク質に合わせてお客様の方でご用意ください。調製方法に関しましては、鋳型DNAのサイトをご覧ください。

注5) 気相の恒温槽(培養用恒温器など)で反応すると、反応液の温度の上昇に時間がかかり、合成量が低くなります。

使用上の注意

DsbC Set(旧 DS supplement)は研究用試薬です。ヒトを含む動物などへの投与、臨床、診断など他の用途への使用を禁じます。また、食品、家庭用には使用しないでください。
DsbC Set(旧 DS supplement)を使用する際には、RNaseフリーの水、試薬、器具類を使用してください。また、手袋、マスクの着用をお勧めします。